Mis on PCR -test?
PCR-test on molekulaarbioloogias ja meditsiinis kasutatav laborimeetod. Testi kasutatakse geneetilise materjali otseseks tuvastamiseks ja iseloomustamiseks. Eksperdid peavad PCR-meetodit hõlpsasti teostatavaks, universaalselt kasutatavaks ja vastupidavaks.
Laboris koosneb PCR-test kahest etapist. Esimeses etapis amplifitseeritakse olemasolev geneetiline materjal polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) abil. See võimaldab uurida DNA väikseimaid jälgi. See on ka põhjus, miks PCR-testid nii tundlikult reageerivad.
Teises etapis eraldatakse geneetiline materjal vastavalt selle omadustele, “sorteeritakse” ja seega iseloomustatakse. Teisisõnu määratakse kindlaks DNA peenstruktuur.
Võimalikke rakendusi on palju: arstid kasutavad PCR-testi näiteks koroonaviiruste esinemise uurimiseks, vereloovutuseks HIV-i tuvastamiseks või vastsündinute võimalike pärilike haiguste tuvastamiseks. PCR abil saab selgitada ka bakteriaalseid infektsioone – näiteks tuberkuloosi patogeeniga – või parasiitnakkusi (malaaria).
Samuti aitavad need kohtumeditsiinis kurjategijaid nende geneetiliste sõrmejälgede põhjal süüdi mõista või kasutatakse isadustestina.
Kui kaua PCR-test kehtib?
PCR-testi tulemus kehtib tavaliselt 48 tundi alates proovi võtmisest.
Kui usaldusväärne on PCR-test?
PCR on järeleproovitud tuvastamismeetod molekulaardiagnostikas ja meditsiinis. Seda peetakse väga madala veamääraga nn kullastandardiks. Teste iseloomustab eelkõige väga kõrge tundlikkus ja spetsiifilisus.
Tundlikkus tähendab usaldusväärsust, millega test tuvastab geneetilise materjali.
Spetsiifilisus tähendab kindlust, millega test teeb kindlaks, et kõnealust geneetilist materjali proovis ei esine.
Millal toimivad PCR-testid Sars-CoV-2 infektsiooni puhul?
Reeglina tuvastab PCR-test koroonanakkuse kaks kuni kolm päeva enne ja kuni 20 päeva pärast sümptomite ilmnemist. Isegi nakatunud inimestel, kes on täiesti sümptomitevabad, on test efektiivne kriitilisel ajaperioodil, mil nad võivad teisi nakatada.
Üksikjuhtudel on avastamine võimalik isegi 60 päeva pärast sümptomite tekkimist.
Võimalikud veaallikad
DNA kopeerimisprotsessi veamäär on praktikas tühine. Kuigi DNA polümeraasid ei ole kunagi vigadeta, ei mängi nad PCR-i testimisprotseduuris peaaegu mingit rolli.
Praktikas peituvad potentsiaalsed veaallikad pigem proovide võtmises: seetõttu on oluline, et tampooniproove viiksid läbi koolitatud meditsiinitöötajad. Sülje- ja kuristusvedeliku proovid võivad testi täpsust vähendada, kuna siin ilmnevad lahjendusefektid.
Kuidas PCR-test töötab?
PCR-testi teeb näiteks perearst või spetsiaalsetes testimiskeskustes. Esiteks võtavad arstid või koolitatud meditsiinitöötajad proovi. Tavaliselt võetakse analüüsi jaoks tampooni ülemistest hingamisteedest. Tavaliselt võetakse see suu või ninaneelu tampooni kujul.
Võimalik on ka loputuslahusega kuristamine. Vereproov on koroona tuvastamiseks ebatüüpiline, kuid seda kasutatakse laialdaselt näiteks vastsündinute sõeluuringus.
Olenemata võetud proovi tüübist leitakse geneetiline materjal vatipulgalt, loputuslahusest või veretilgast. See proovimaterjal saadetakse laborisse, kus see eraldatakse ja puhastatakse.
Seejärel jagatakse PCR-test kaheks etapiks:
- PCR: selles etapis amplifitseeritakse algse geneetilise materjali kogust.
1. samm: PCR – polümeraasi ahelreaktsioon
"PCR" on esimene kahest etapist: see on koht, kus saadaoleva lähte-DNA kogust amplifitseeritakse. Seda seetõttu, et geneetilist materjali saab analüüsida alles siis, kui seda on piisavas koguses saadaval. Enamasti on selleks inimese DNA; koronaviiruse testide puhul on see viiruse RNA.
Lühend PCR tähistab polümeraasi ahelreaktsiooni.
Mida on vaja PCR-i jaoks?
Algne DNA asetatakse spetsiaalsete ainetega reaktsioonianumasse. Olemasolev geneetiline materjal toimib mallina, mis kopeeritakse teatud ensüümide (Taq polümeraas) ja teatud põhiliste DNA ehitusplokkide juuresolekul.
Kopeerimisprotsess toimub mitme korduva käiguna (tsüklina).
Täpsemalt lisatakse järgmised ained:
- Algne DNA: proovimaterjal, mida tuleb kopeerida.
- Põhilised DNA ehitusplokid: need on nukleoalused adeniin, tümiin, tsütosiin ja guaniin.
- DNA polümeraas: ensüüm, mis seob üksikuid DNA ehitusplokke, moodustades täpselt määratletud DNA ahela. Äsja saadud ahel on algse lähtematerjali peegelpilt (komplementaarne).
- Praimerid: need koosnevad 16–24 aluspaarist ja toimivad lähtepositsiooni ja stardisignaalina. Praimerid näitavad DNA polümeraasi, millises positsioonis (algus-DNA) kopeerimisprotsess algab.
Kuidas PCR-testi tehakse?
Nüüd, kui kõik PCR-i jaoks vajalikud ained on reaktsioonianumas olemas, võib alata tegelik geneetilise materjali kopeerimisprotsess. Seda käivitab, juhib ja peatab uuesti ainult temperatuur.
Seetõttu kuumutatakse või jahutatakse reaktsioonianumat üksteise järel erinevatele temperatuuridele. Seda tehakse spetsiaalse seadmega, mida nimetatakse termotsükleriks. Kogu reaktsioon kestab umbes üks kuni kaks tundi.
PCR-tsükli üksikud etapid on
- DNA kaksikahelate denatureerimine: proovi kuumutatakse umbes 90 kraadini Celsiuse järgi. See eraldab algse DNA kaksikahela kaheks individuaalseks (komplementaarseks) üksikuks ahelaks.
- Kruntvärvide kinnitamine: temperatuur alandatakse veidi alla 60 kraadi Celsiuse järgi. See põhjustab praimerite (eespidine praimer, pöördpraimer) kinnitumise vastavate üksikute DNA ahelate määratletud positsioonidele.
Pärast tsükli lõppemist tõstetakse temperatuur uuesti umbes 90 kraadini – tsükkel algab uuesti algusest.
PCR-meetodit saab kasutada kuni umbes kolme kiloaluspaari (kbp) DNA järjestuste amplifitseerimiseks. See vastab umbes 3,000 põhilisele DNA ehitusplokile, mis on omavahel ühendatud, moodustades "ahela". Võrdluseks: inimese genoom talletab raku tööks vajalikke plaane ja informatsiooni umbes kolmes miljardis aluspaaris – koroonaviiruse genoom seevastu koosneb 30,000 XNUMX aluspaarist. Seetõttu saab PCR-testiga amplifitseerida ja uurida ainult kogu DNA lühikesi osi.
Praimerid on üliolulised
Praimerite valik on PCR-protseduuri jaoks ülioluline. Sars-CoV-2 diagnostikas kasutatakse näiteks mitmeid praimereid (multiplex PCR).
Corona PCR testid otsivad seega kolme erinevat viiruse geeni: see suurendab üldist spetsiifilisust peaaegu 99.99%. See tähendab, et selle kõrge tabamusmäära korral on 10,000 XNUMX testi kohta ainult üks valepositiivne test (kui proovid võetakse õigesti).
Kui palju kopeeritud geneetilist materjali on nüüd saadaval?
Oletame, et pärast esimest tsüklit on kaks identset DNA kaksikahelat.
Pärast iga tsüklit kahekordistub (kopeeritud) geneetilise materjali hulk. Seetõttu kasvab DNA hulk eksponentsiaalselt.
Arstid kordavad seda protsessi tavaliselt umbes kakskümmend kuni kolmkümmend korda.
Piltlikult öeldes tähendab see seda, et isegi kui proovis leitakse alguses vaid üks DNA kaksikahelaline ahel, on kahekümne tsükli järel reaktsioonianumas juba miljon identset koopiat.
Mida tähendab Ct väärtus?
Läbiviidud PCR-tsüklite arv on näidatud nn Ct väärtusena. “Ct” on tuletatud ingliskeelsest terminist “cycle threshold”. See Ct väärtus võimaldab teha väiteid otsitava geneetilise materjali koguse kohta.
Madala Ct väärtusega 20 on algset geneetilist materjali palju. Kui aga Ct väärtus on kõrge – umbes 30 tsüklit – on DNA-d vastavalt vähe. Seetõttu tuleb PCR-i tsüklit läbi viia sagedamini.
2. samm: elektroforees "Sortimine suuruse järgi"
Kui on olemas piisavalt rikastatud geneetilist materjali, saab läbi viia elektroforeesi. Selles protsessis kasutavad teadlased DNA spetsiifilist omadust: selle elektrilaengut.
Üksikud DNA ehitusplokid on üksteisega seotud (negatiivselt) laetud suhkru-fosfaadi karkassi kaudu. Mida pikem on konkreetne DNA järjestus, seda suurem on selle elektrilaeng.
See võimaldab geneetilist materjali uurida ja iseloomustada. Praktikas joonistatakse tundmatu valim tavaliselt nn stardijoonele tuntud viite suhtes ja võrreldakse neid teatud aja möödudes.
Kui „rändekiirus” on mõlema järjestuse puhul sama, tähendab see, et tuvastamine on suure tõenäosusega positiivne: Tuvastamine on väga tõenäoliselt positiivne – proovis sisaldub otsitav geen.
Koronaviiruse erijuhtum: proovide ettevalmistamine ja RT-PCR
Koroonaviiruse avastamine on erijuhtum. Sars-CoV-2 on üks niinimetatud RNA viirustest. See tähendab, et Sars-CoV-2 geneetiline materjal esineb RNA (ribonukleiinhappe) kujul.
RNA erineb DNA-st vaid mõne aspekti poolest. Muuhulgas esineb see ühe ahelana ja põhineb 2'-desoksüriboosi asemel suhkruriboosil. Nukleoalus tümiin on samuti asendatud uratsiiliga neljanda alusena.
See viiruse RNA tuleb enne tavalist PCR-testi "transkribeerida" DNA-ks. Seda protsessi nimetatakse pöördtranskriptsiooniks (RT) – sellest ka termin RT-PCR. Selle protsessi käigus saadakse üks cDNA ahel (“komplementaarne DNA”). Järgmises etapis täiendatakse cDNA üksikut ahelat teise peegelpildiga DNA ahelaga.
Kui kaua kulub tulemuseni jõudmiseks?
Kui proov on laborisse saadetud, saate tulemuse tavaliselt ühe-kahe tööpäeva jooksul. Katsekeskustes, kus uuritakse proove sageli otse kohapeal, võib selleks kuluda ka vaid paar tundi. Ajavahemik sõltub suuresti vastavast testimiskeskusest ja selle logistikast.
Hoolimata keerulistest tööprotsessidest suudavad kaasaegsed laborid läbi viia suure läbilaskevõimega PCR-analüüse. Teste aitavad läbi viia spetsiaalsed automatiseeritud seadmed.
Sellegipoolest peetakse PCR-testi suhteliselt "aeglaseks", kuid seda usaldusväärsemaks tuvastamismeetodiks.
Mis juhtub, kui tulemus on positiivne?
Kui proov on õigesti võetud, tähendab positiivne PCR-test, et on väga suur tõenäosus, et uuritav on nakatunud Sars-CoV-2-sse.
Kui teil on PCR-testi abil kinnitatud koroonaviirusesse nakatumine, saab rahvatervise osakond vastavast laborist positiivse testitulemuse teate. Sel juhul määrab rahvatervise osakond isoleerimise või karantiini.
Kas ma olen automaatselt nakkav, kui PCR-analüüs on positiivne?
Tavaliselt jah. Aga mitte alati. PCR-testi tulemust tuleks alati tõlgendada kontekstis. Positiivne test tähendab ennekõike seda, et kannate viiruslikku materjali.
Mõnikord on kasulik täiendav antikehade test
Sellistel juhtudel annab antikeha test kindluse, mis kinnitab PCR-testi kehtivust. Kõige parem on seda oma arstiga arutada. Need aitavad teil PCR-testi tulemust õigesti tõlgendada.
Mida teha, kui tulemus on negatiivne?
Negatiivne PCR-testi tulemus tähendab suure tõenäosusega seda, et teil ei olnud proovi võtmise ajal Covid-19 ja te ei ole seetõttu praegu nakkav. Siiski võite olla nakatumise varases faasis.
Koroonainfektsioone saab tavaliselt avastada alles teisel või kolmandal päeval pärast nakatumist. Tulemuseks ei ole seega vabapääs. Seetõttu peaksite jätkama sotsiaalse distantseerumise ja hügieenireeglite järgimist ning jätkama FFP2 maski kandmist – enda ja teiste kaitseks.
PCR test lastele
Lastele mõeldud PCR-test ei erine täiskasvanute PCR-testist. Nii proovide kogumine kui ka tulemuste tõlgendamine kehtivad nii lastele kui ka täiskasvanutele.
Millised on PCR-testi riskid?
PCR-testiga ei kaasne füüsilisi riske. Mõned inimesed peavad häirivaks või ebameeldivaks ainult proovi võtmist ninaneelu tampooniga.
Mis maksab PCR-test?
Pange tähele: kui olete end kodus testinud ja saanud positiivse tulemuse, peaksite viivitamatult telefoni teel perearsti vastuvõtule panema. Teie arst arutab teiega telefoni teel järgmisi samme.
Teise võimalusena on PCR-testi registreerimiseks kõige parem helistada numbril 116 117. Ideaalis tuleks enda ja teiste kaitsmiseks jääda kinnitustestini koju.
