In situ hübridisatsioon on meetod kromosomaalsete kõrvalekallete tuvastamiseks. See hõlmab spetsiifilist märgistamist kromosoomid jahuküllastega värvained ja siduda need DNA sondiga. Seda tehnikat kasutatakse geneetiliste mutatsioonide sünnieelse diagnoosimise jaoks.
Mis on in situ hübridisatsioon?
In situ hübridiseerimine hõlmab spetsiifilist märgistamist kromosoomid jahuküllastega värvained ja siduda need DNA sondiga. Seda tehnikat kasutatakse prenataalseks diagnoosimiseks geen mutatsioonid. In situ hübridisatsioon või fluorestsents in situ hübridisatsioon hõlmab molekulaarse geneetilise avastamise nukleiinhapped RNA või DNA spetsiifilistes kudedes või rakus. Tavaliselt kasutatakse seda tüüpi diagnostikat struktuurse või arvulise kromosomaalse anomaalia tuvastamiseks rasedus. Sel eesmärgil kasutatakse kunstlikult toodetud sondi, mis ise koosneb nukleiinhappest. Seejärel seondub see nukleiinhapped organismis aluse paaristamise teel. Sellele seondumisele viitab termin hübridiseerimine. Avastamine viiakse läbi patsiendi elustruktuuril ja vastab seetõttu in situ tuvastamisele. Sellest tuleb eristada in vitro meetodeid, mille käigus tuvastamine toimub katseklaasis. Meetodi töötasid 20. sajandil välja teadlased Joe Gall ja Mary Lou Pardue. Sellest ajast alates on tehnika arenenud. Näiteks kui sel ajal kasutati radioaktiivseid sonde, siis fluorosentsiga märgistatud sondid, millel oli kovalentne side molekulid kasutatakse tänapäeval.
Funktsioon, mõju ja eesmärgid
In situ hübridisatsiooni kasutatakse tavaliselt kromosomaalsete aberratsioonide, kromosoomide kõrvalekallete tuvastamiseks, mida ei ole võimalik tuvastada karüogrammist. Seega kasutatakse meetodit alati siis, kui pärilikud haigused tuleb määrata ajal rasedus. Kuna kromosomaalsed aberratsioonid on probleem, mida ei tohiks tänapäeval alahinnata, on meetodi rakendamine aja jooksul suurenenud. Hübridiseerimine viiakse läbi ema emakeelsete rakkude abil lootevesi. Tehnika aluseks on värvimärgistatud sondi seondumine DNA fragmentidega. Tänu köitmisele saab koopiate arvu hindamiseks hiljem kasutada mikroskoopi, kuna üksikud koopiad kiirgavad valgussignaali ja on seega mikroskoobi all nähtavad. Selleks on erinevad protseduurid. Kumbki analüüs toimub kohe pärast sidumist. Sellisel juhul on selline fluorestsentsvärv nagu biotiin kasutatakse otse DNA sondiga. In situ hübridiseerimise kaudse meetodi korral ei saa analüüsi teha kohe pärast hübridisatsiooni, sest fluorestseerivad ained saavad prooviga seonduda alles pärast hübridisatsiooni. Seda kaudset meetodit kasutatakse sagedamini kui otsest meetodit, kuna seda peetakse tundlikumaks. Tehnikate hulka kuuluvad kromosoomispetsiifilised tsentromeetri DNA sondid, lookusespetsiifilised DNA sondid, kromosoomispetsiifilised DNA raamatukogu sondid ja võrdlevad genoomi hübridisatsioonid. Kromosoomispetsiifiliste tsentromeer-DNA sondide abil saab tuvastada kromosoomide arvulisi kõrvalekaldeid. See tähendab, et neid kasutatakse peamiselt dubleerimisel või kustutamisel kromosoomid kahtlustatakse. Lokus-spetsiifilised DNA sondid sobivad peamiselt minimaalsete mutatsioonide tuvastamiseks, mida ei saa karüogrammist tuvastada. Kromosoomispetsiifilist DNA raamatukogu sondi kasutatakse eelkõige insertsioonide ja translokatsioonide tuvastamiseks. Võrdlev genoomi hübridiseerimine on seevastu kromosomaalse materjali kadude ja juurdekasvu põhjalik analüüs. Tänapäeval on mitmesuguste kromosomaalsete mutatsioonide diagnostikas in situ hübridiseerimine väga oluline. Diagnostikas Downi sündroomnäiteks seonduvad sondid kromosoomiga 21. Sel eesmärgil kasutatakse tavaliselt kromosoomispetsiifilisi sonde, mida saab rakendada selle haiguse kahtluse korral. Kahtlus võib tekkida näiteks siis, kui vanemad on varem sünnitanud selle haigusega lapse ja ultraheli pilt on silmatorkav. Kui on kolmekordne ja mitte kahekordne lips, mille tulemuseks on kolmevärviline signaal, loetakse diagnoos kinnitatud.
Riskid, kõrvaltoimed ja ohud
Erinevalt näiteks PCR-st on in situ hübridisatsioon saastumisele palju vähem vastuvõtlik. Lisaks on protseduuri jaoks kuluv aeg tohutult lühem. Kuna aga eelkõige embrüod moodustavad kromosoomimustrid, ei saa ühtegi olemasolevat mustrit kasutada ülejäänud kromosoomide kindlaks järeldamiseks. jaotus ja seega ka teiste rakkude geneetiline seisund. Värvisignaalid võivad ka teistel põhjustel kattuda või jääda nähtamatuks. Seega in situ hübridisatsioon kui diagnostiline vahend ajal rasedus on suhteliselt altid eksimisele. Võib esineda valediagnoose ja vanemad võivad otsustada tervislike vastu embrüo. In situ hübridisatsiooni veaprobleemide vähendamiseks tuleks samaaegselt uurida vähemalt kahte embrüonaalset rakku. Kahte rakku paralleelselt uurides on nüüd valediagnoosimise oht vaid tühine. Seetõttu saavad vanemad sellisel juhul diagnoosile tugineda. In situ hübridisatsiooni ei pakuta igale rasedale naisele, vaid ainult riskirühma kuuluvatele naistele. Sellest hoolimata ei keelata rasedatele seda tüüpi diagnoosi nende endi soovil. Ebanormaalne ultraheli leiud või ebanormaalne seerum võivad ajendada arsti diagnostilist protseduuri pakkuma. Tänapäeval saab in situ hübridisatsiooni abil diagnoosida suur osa kromosomaalsetest kõrvalekalletest, kuid sugugi mitte kõiki. Seetõttu ei tohi hübridiseerimist in situ kunagi teha üksi, vaid seda tuleb alati kasutada koos tavapärase kromosoomitestiga. Selles protseduuris mängib suurt rolli rasedate hooldus. Seetõttu toimub enne analüüsi tulevase emaga põhjalik arutelu diagnostikameetodi üle, teavitades teda riskidest, võimalustest ja tehnika piirangutest.
