Patch-clamp tehnika on nimi, mida nimetatakse elektrofüsioloogiliseks mõõtmistehnikaks. See võimaldab ioonvoolusid mõõta plasmamembraani üksikute kanalite kaudu.
Mis on plaastri-klambri tehnika?
Plaasterklambri tehnika ehk plaasterklambri meetod kuulub elektrofüsioloogiasse, mis on neurofüsioloogia haru, mis tegeleb signaalide elektrokeemilise ülekandega närvisüsteem. Selle meetodi abil on võimalik visualiseerida üksikuid ioonkanaleid rakumembraan keharakust. See hõlmab mõne picoamperi voolude mõõtmist. Plaastri-klambri tehnikat kirjeldasid esmakordselt 1976. aastal saksa biofüüsik Erwin Neher ja saksa arst Bert Sakmann. Need kaks teadlast pälvisid 1991. aastal klambriplaastri tehnika arendamise eest Nobeli füsioloogia- või meditsiinipreemia. Seega muutsid elektrofüsioloogilised uuringud plaastri-klambri tehnikaga peaaegu pöörde, kuna see avas võimaluse jälgida membraani elektrilist käitumist valgud üksikisiku molekulid. Termin plaaster pärineb inglise keelest ja tähendab "plaaster". See viitab väikesele membraanilõigule plaastri pipeti all, mida kasutatakse mõõtelektroodina. Mõõtmisprotsessi käigus fikseeritakse või kinnitatakse (kinnitatakse) membraanplaaster kindlaksmääratud potentsiaalide külge.
Funktsioon, mõju ja eesmärgid
Plaastri-klambri tehnika on elektrofüsioloogiline analüüsimeetod. See põhineb bioloogilisel faktil, et rakkudel on suur hulk poore ja ioonikanaleid. Igas rakus sees ja väljas esinevad erinevad ioonide kontsentratsioonid või laengud, mis sõltuvad raku füsioloogilisest seisundist. Membraani lipiidne kahekihiline kiht ei ole seda läbilaskev vesi molekulid samuti ioonid. Sellegipoolest toimub laetud osakeste vahetus kogu rakumembraan ebaregulaarsete vahedega. Selle põhjuseks on ioonkanalite sõltuvus pingest. Teatud membraanipotentsiaali saavutamisel avatakse kanalid põhimõttel "kõik või mitte midagi". See on täpselt see koht, kus plaastri klambertehnika sisse tuleb. Sel viisil viiakse mõõtepipett ioonikanalisse, ilma et see tungiks rakumembraan. Nii saab kohaliku elektrilise potentsiaali täpselt kindlaks määrata. Lekkevoolusid, mis võivad mõjutada mõõtmise tulemust, saab tavaliselt vältida elektriliselt ülitihedate ühendustega pipeti serva ja rakumembraani vahel. Plaasterklambri meetod põhineb pingeklambri tehnikal. Selle tehnika töötas 1930. aastatel välja Ameerika biofüüsik Kenneth Stewart Cole (1900-1984) tervete närvirakkude voolude mõõtmiseks. Pingeklambris toimub kahe elektroodi sisestamine lahtrisse, et anda käsk või hoidepinge. Samal ajal kasutatakse membraani kaudu tekkivate voolude registreerimiseks teist elektroodi. Kui neurofüsioloogid tahavad teada saada elektrivoolude voogudest läbi a närvirakk membraani, kasutavad nad plaastri klambri tehnikat. Selleks kasutavad nad raku välisküljele asetatud peent klaasist pipetti. Negatiivset rõhku saab tekitada hüpodermilise süstla abil. See protseduur paneb membraani vastavas kohas veidi välja punnitama. Alarõhk tagab klaasi membraanile kinnitamise. Selle tulemusena eraldatakse pipetis olev väike membraanilaik elektriliselt ülejäänud membraanist. Elektrivoolude mõõtmiseks kasutavad neurofüsioloogid plaastri klambri võimendit. See on spetsiaalne mõõteseade. Ideaalsel juhul saab teadlane seadet kasutada teabe saamiseks üksikute ioonkanalite elektriliste omaduste kohta. Ioonkanalid reguleerivad näiteks sisse- ja väljavoolu naatrium positiivselt laetud ioonid närvirakkudes. Uurimine toimub inimeste, taimede või loomade rakkudel. Plaaster-klambri meetod viiakse tavaliselt läbi mõõtmisjaamas, mis sisaldab erinevaid seadmeid. Vibratsioonist summutatud mõõtelaual on nn Faraday puur, mis toimib elektrikilbina. Lisaks on plaastripipeti paigale viimiseks saadaval optiline mikroskoop, mis sisaldab mikromanipulaatorit. Lisaks on pipetihoidjal ühendus eelvõimendiga, samas kui proovihoidik on ühendatud vannielektroodiga. Plaasterklambri võimendi toimib eelvõimendi signaali võimendamiseks. Samuti on olemas monitor DUT-i ja plaastri pipeti jälgimiseks. Enamasti on digitaalse salvestamise võimaldamiseks mõõtelauas saadaval ka arvuti ja mitu andmesalvestusseadet.
Riskid, kõrvaltoimed ja ohud
Plaastri-klambri tehnikaga ei kaasne riske. Näiteks uuritakse inimeste, loomade või taimede rakke alles pärast nende eemaldamist. Rakuvälisele membraanile on piiratud juurdepääs harva. Sel põhjusel on sageli vaja rakke plaastri-klambri meetodi jaoks ette valmistada. Pärast plaastri pipeti täitmist kinnitatakse see mikromanipulaatorisse. See on ühendatud plaastri klambri võimendiga ja surutakse ettevaatlikult tervele rakule. Protsessi saab jälgida monitori või mikroskoobiga. Pipeti all istub membraanitükk, mida nimetatakse membraanilaiguks. Pipeti tagumisse otsa tekkiv kerge alarõhk tagab tugeva ühenduse pipeti ja membraani vahel. Selle protsessi tulemusena luuakse elektritakistus välise lahuse ja mitme gigaohmi pipeti sisemuse vahel. Teadlased nimetavad seda ka kui "gigaseal", mis võimaldab saavutada plaastri-klambri meetodi rakkudega seotud konfiguratsiooni. Plaastris oleva ioonkanali kaudu voolav vool voolab kõrge gigaseaalse takistuse tõttu ka pipeti sisust. Võimendiga ühendatud elektrood sukeldatakse pipeti lahusesse, võimaldades mõõta plaastri membraani üksikute ioonkanalite aktiivsust.
