Polümeraasi ahelreaktsioon tähistab molekulaarbioloogia protseduuri, mis dubleerib geneetilisest materjalist sektsioone (desoksüribonukleiinhape, DNA). Väikesest kogusest DNA-st saadakse miljoneid ühesuguseid koopiaid. Nii on saadaval kogused, mis on piisavad erinevateks uuringuteks.
Mis on polümeraasi ahelreaktsioon?
Polümeraasi ahelreaktsioon kujutab endast molekulaarbioloogia meetodit, mis dubleerib geenimaterjalist lõigud (desoksüribonukleiinhape, DNA). Mõiste polümeraasi ahelreaktsioon (PCR) kirjeldab in vitro (ladina keeles: klaasis) reaktsiooni ensüümi polümeraasi (DNA polümeraas) abil, mis viib teatud geen järjestused. Reaktsiooni saadus on ka selle reaktsiooni uue tsükli lähteaine. Nende arv molekulid kahekordistab ja on samal ajal uue tsükli mall. Seda nimetatakse eksponentsiaalseks korrutamiseks. See toimub laboris suure, mõne minutilise kiirusega, sarnaselt ahelreaktsiooniga. See laboriprotsess jäljendab geneetilise teabe (DNA) dubleerimist, mis toimub replikatsiooni käigus looduslikes tingimustes. Ameerika keemikut KB Mullist peetakse selle protsessi avastajaks. 1983. aastal tutvustas ta seda DNA sünteesiprotsessi ja kümme aastat hiljem anti talle Nobeli keemiaauhind.
Funktsioon, mõju ja eesmärgid
Elusorganismides sisalduv DNA kromosoomid on pikkusega, mida ei saa PCR abil võimendada. Selle asemel rakendatakse seda määratletud sektsiooni võimendamiseks. Need võivad olla geenid, a spetsiifiline osa geenvõi piirkonnad, kuhu pole ümber kirjutatud valgud, st on kodeerimata. Need sektsioonid hõlmavad tavaliselt mitte rohkem kui kolme tuhat aluspaari, võrreldes umbes kaks korda kolme miljardi aluspaariga komplekti kohta kromosoomid inimestel. Polümeraasi ahelreaktsioon nõuab ühe- või kaheahelalist DNA-ahelat, mille struktuur peab olema vähemalt osaliselt teada. Lisaks ensüümile, polümeraasile, kasutatakse kahte praimerit. Need on DNA ehitusplokid, mis toimivad algus- ja lõpp-punktina. Neid iseloomustab järjestus, mis sobib täpselt amplifitseeritava piirkonnaga. Laboris viiakse polümeraasi ahelreaktsioon läbi programmeeritavas kuumutusplokis. Vajalikud komponendid nagu polümeraas, praimer, uue ahela ehitamiseks vajalikud ehitusdetailid (desoksüribonukleosiidtrifosfaadid) ja magneesium ioonid lisatakse kokku puhverlahuses. Reaktsiooni temperatuuri ja aja programm algab denatureerimisega temperatuuril üle 94 ° C. Selles protsessis lõhustatakse kaheahelaline DNA ja see on üheahelalises vormis. Järgmises etapis, umbes 70 ° C juures, seotakse praimer geen järjestus ja moodustab ensüümi reaktsiooni alguspunkti. Siit sünteesib polümeraas komplementaarse ahela. Seejärel algab uus tsükkel, mis koosneb uuesti DNA-ahela denatureerimise, praimeri sidumise ja sünteesi kolmest etapist. Polümeraasi ahelreaktsiooni kasutatakse kohtumeditsiinis, kliinilises diagnostikas ja kliinilistes uuringutes. Kohtuekspertiisis eraldatakse DNA nahk, sülg, juuksed, sperma või veri kuriteopaigast ja pärast võimendamist võrreldud tuntud proovidega ja kasutatud konkreetsete isikute tuvastamiseks. Selle geneetilise sõrmejälje abil saab isadust selgitada ka muudetud lähenemisviisiga. Haiguste selgitamisel kasutatakse polümeraasi ahelreaktsiooni kaasatud geenide kontrollimiseks. Mõningaid bakteriaalseid haigusi saab liigitada, tuvastades spetsiifilised järjestused. Viirushaigusi saab iseloomustada, kui viiruse DNA või RNA transformeeritakse ja amplifitseeritakse. Sisse veri skriining, on võimalik tuvastada hepatiidi või HIV-vahendatud haigused väga varajases staadiumis. Kasvaja diagnostikas kasutatakse seda kasvajarakkude tuvastamiseks. See võimaldab kasvajat klassifitseerida, hinnata haiguse kulgu ja haiguse edukust ravi ja prognoos. Uuringutes kasutatakse polümeraasi ahelreaktsiooni erinevate haigustega seotud geenide tuvastamiseks. Geenikloonimiseks, mis ei ole sama mis organismi kloonimine, amplifitseeritakse geen enne vektoris teistele organismidele kandmist (ladina keeles: reisija, kandja ). Need võivad olla haiguste paremaks uurimiseks või tootmiseks eeskujuks valgud mida saab kasutada kui ravimid.
Riskid ja ohud
Polümeraasi ahelreaktsioonil on tohutu potentsiaal DNA väikeste koguste tuvastamisel. Võimaluste paljususe ärakasutamiseks ja oluliste vigade eest kaitsmiseks tuleb arvestada teatud eelduste ja erinevate vigade allikatega. Ainult neid geneetilise materjali osi, mille järjestus on vähemalt osaliselt teada, saab võimendada. Selle meetodiga ei saa võimendada täiesti tundmatuid järjestusi. Võimenduse saadusi saab hiljem visualiseerida. Kui oodatav signaal pole nähtav, kuigi otsitud järjestus oli olemas, on vale negatiivne tulemus. Kõige sagedamini on see tingitud optimeerimata või halvasti optimeeritud reaktsioonitingimustest. Need tuleb määrata sihtjärjestuse funktsioonina. Sel eesmärgil testitakse reaktsioonisegus erinevaid temperatuuri- ja ajaprofiile, praimeri järjestusi ja koguseid, samuti teiste ainete kontsentratsioone. Vale positiivsed tulemused ilmnevad signaalidena, mida ei saa soovitud tootele omistada. Suuremaid probleeme põhjustavad uurija või muust kui analüüsitavast allikast pärinevad saastumised DNA-ga. Bakteriaalse päritoluga DNA mõjutab ka polümeraasi ahelreaktsiooni tulemust. Kindaid kandes ja väga ettevaatlikult saab selliseid vigu ära hoida ja teha usaldusväärseid järeldusi võimendatud toodete kohta.
