Pange tähele: järgmine artikkel on lisatud teiste tavapäraste ravimeetodite alla, kuna eraldi osa pole veel saadaval meditsiinilise eksperimentaalse molekulaarbioloogia meetodite jaoks. CRISPR / Cas-meetod on molekulaarne bioloogiline meetod DNA sihipäraseks lõikamiseks ja modifitseerimiseks (genoomi redigeerimine; geen käärid). 1987. aastal avastasid teadlased varem jälgimata adaptiivi immuunsüsteemi E. colis. See põhineb nn CRPSPR järjestustel (rühmitatud regulaarselt vahepealsete lühikeste palindroomsete kordustega) DNA-s. E. coli integreerib bakteriofaagide (rühma B) DNA viirused mis on spetsialiseerunud bakterid peremeesrakkudena) oma DNA CRSPR järjestus, transkribeerides seega crRNA (DNA ümberkirjutamine RNA-ks). CrRNA koosneb nii vahe- kui kordusjärjestustest. Spacer järjestused on järjestusest "ekstraheeritud" järjestused bakterid. Nn trRNA (tracrRNA) seondub nimetatud korduvate järjestustega. See värbab ensüümi CAS9. Nüüd on olemas kompleks - crRNA: tracrRNA: Cas9 kompleks -, mis on võimeline seondama bakteriofaagi DNA, mis on komplementaarne crRNA kosmosjärjestustega. Niinimetatud endonukleaasina (DNA lõikav ensüüm, seega restriktsiooniensüüm) lõikab CAS9 viiruse DNA kaheahelaliselt, mis viib lõppkokkuvõttes replikatsiooni võimetuseni (st edasise replikatsiooni puudumiseni ja sellest tulenevalt edasise integratsioonita). Üle kümne aasta on seda protseduuri kasutatud rõhuasetusega genoomi redigeerimise uuringutes. Kirjeldatud „crRNA: tracrRNA: Cas9 kompleks“ on universaalselt rakendatav taimedele ja loomadele ning võimaldab geenide eemaldamist (kustutamine) ja täielikku vaigistamist. Põllumajanduses ja toidukultuurides on põllutaluvuse ning viiruslike patogeenide vastase immuniseerimise tugevdamiseks enam kui 5 aastat leitud kasutamist väljaspool teadusuuringuid. Seda protseduuri võiks hiljem kasutada inimmeditsiinis. Alates 2020. aastast on esmakordselt kaasasündinud haigusega raviv ravimeetod süda defekt (vitium) lastel. Vitium on osa komplekssest pärilikust haigusest Noonani sündroom (autosoomne retsessiivne või autosoomne dominantne pärand). Pärast LZTR1 põhjuslike variantide dešifreerimist geen, genereeritud indutseeritud pluripotentsete kardiomüotsüütide sobiv geeniparandus (süda tehti kaksikute tüvirakkudest. The geen reguleerib rakkude diferentseerumise ja kasvu olulisi signaalimisteid.
Enne seda potentsiaalset ravi inimmeditsiinis
Vanemate pärilike häirete molekulaarne geneetiline testimine, sealhulgas põhjalik geneetiline nõustamine.
Protseduur
Protseduur sarnaneb E. coli kaitsemehhanismiga, mida on kirjeldatud dokumendis immuunsüsteemi. Selles protsessis saab crRNA vaheruumi modifitseerida järjestusespetsiifilise kaheahelalise komplementaarse DNA lõikamiseks, mille tulemuseks on sihipärased deletsioonid. Keemiliselt modifitseeritud trRNA: crRNA molekuli nimetatakse juhendRNA-ks. Selleks on vaja kahte erinevat crRNA: tracrRNA: Cas9 kompleksi, et kinnituda DNA kahele saidile. Pärast DNA fragmendi eemaldamist toimub 2. DNA fragmentide ensüümidega seotud seondumine ligaaside abil. See erineb pelgalt DNA järjestuse lõikamisest nagu bakteris. Aastate jooksul on lisatud olulisi modelleerimisvõtteid. Need võimaldavad mitte ainult deletsioone DNA ahelas, vaid ka uute DNA nukleotiidide lisamist (insertsioone). Kõige paljutõotavam muudatus on peamine redigeerimine. Siin järgneb DNA fragmendi kustutamisele ja seega eemaldamisele uue DNA fragmendi sisestamine. Niinimetatud pegRNA (esmane redigeerimisjuhend RNA) on siin saadaval sisestatava DNA transkriptina. Pöördtranskriptaasi abil transkribeeritakse pegRNA DNA-sse ja inkorporeeritakse DNA-sse, kasutades uuesti ligaase. Selle protsessi jaoks vajalik CAS9 valk tekitab kaheahelaliste jaotustükkide asemel üheahelalisi. See võimaldab sisestada uue DNA fragmendi täpse sobivusega väljaulatuvate otstega lõigatud DNA ahelasse. Uus modifikatsioon on päriliku haiguse taustal tulevikus „patoloogilise“ DNA järjestuse „mittepatoloogilisele“ vahetamiseks ülitähtis.
Pärast teraapiat
Taas tehakse genoomi sõelumine, et kinnitada genoomi redigeerimise edukust.
Võimalikud tüsistused
GuideRNA võimalike aluste mittevastavuste tõttu võivad esineda sihtmärgivälised efektid, st seondumine soovimatus kohas. Need võivad põhjustada punktmutatsioone (aluse muutused), sisestusi (täiendavate nukleotiidide või DNA järjestuste lisamine DNA järjestusse), deletsioone (… kadu), translokatsioone (DNA positsiooni muutus) ja inversioone (pööratud DNA segmendi olemasolu 180 kraadi). Ensüüm CAS9 ei lõika igal juhul soovitud kohas. Kuid spetsiifilisuse suurenemine on juba toimunud valgu kujunduse muutmise kaudu. Samuti ühendades CAS9 endonukleaasiga Fokl, mis on samuti saadud bakterid, spetsiifilisust võiks suurendada 1: 10,000 1-ni (ilma muude muudatusteta ainult spetsiifilisus kuni 2: XNUMX).
